2025/06/16
01、層析介紹 1 什么是層析? 層析(Chromatography),又稱色譜法,是一種物理化學分析方法。 利用不同樣品與固定相和流動相之間的作用力的差別(如分配、吸附、離子交換等),當兩相做相對移動時,各溶質在兩相間進行多次平衡,從而實現相互分離。 通常包括凝膠過濾層析、親和捕獲層析、離子交換層析、疏水層析、復合模式層析 2 什么是親和層析? 親和層析(affinitychromatography)指的是利用共價連接有特異配體的層析介質分離蛋白質混合物中能特異結合配體的目的蛋白或其它分子的層析技術。 親和典型的相互作用: 免疫球蛋白-Protein A/G 抗體-抗原(Flag標簽、CaptureSelect hCG、IgG-CH1) 金屬離子-His-tag 谷胱甘肽-GST融合蛋白 酶-底物類似物(絲氨酸蛋白酶-苯甲脒FF) 3 結構與原理 層析填料通常由基架和配基兩部分組成。基架是填料的基礎材料,提供機械強度和化學穩定性,而配基則是與目標分子發生特異性相互作用的基團。 基架 瓊脂糖:常見的基架材料,具有親水性和良好的生物相容性,適用于多種層析技術 交聯葡聚糖:由葡聚糖交聯形成的珠狀凝膠,具有多孔性三維空間網狀孔結構。 配基 離子交換配基:如羧基、磺酸基等,用于離子交換層析,根據電荷相互作用分離分子。 親和配基:如抗體、酶、生物素等,用于親和層析,根據生物分子間的特異性親和力分離目標分子。 疏水配基:如苯基、辛基、丁基等,用于疏水層析,根據分子表面疏水性差異進行分離。 凝膠過濾配基:無特異性配基,根據分子大小進行分離,如瓊脂糖凝膠過濾填料。 基架和配基的選擇取決于具體的分離需求和目標分子的性質。通過選擇合適的基架和配基,可以優化層析分離效果,提高目標分子的純度和回收率。 02標簽蛋白親和純化 標簽蛋白純化原理 將某種標簽基因插入表達系統,標簽蛋白和目的蛋白的N端/C端與進行融合表達,得到的融合蛋白。由于標簽與某些物質(如金屬離子Ni/Cu/Zn、葡聚糖等)具有特異性吸附作用,因此可以用于蛋白質的捕獲、富集與純化。 標簽類型:His/Flag/GST/MBP… His標簽蛋白純化填料選擇策略 His標簽純化產品:鎳離子填料與預裝層析柱,目前,Cytiva擁有4款親和層析填料, 分別為:Ni Sepharose 6 Fast Flow、Ni Sepharose High Performance、Ni Sepharose excel、TALON Superflow 03、抗體純化-Protein A 親和層 1 Protein A/G 純化簡介 抗體親和層析是一種利用抗原與抗體之間高度特異性親和力進行生物分子分離純化的技術 Protein A和Protein G分別是金黃色葡萄球菌和G類鏈球菌中分離出來的胞壁蛋白。 Protein A是暴露在金黃色葡萄球菌細胞壁蛋白質,分子量42 kD,蛋白A含有5個可以和抗體IgG分子的Fc段特異性結合的結構域,因具有高親和性、高純化效率的特點而被作為單抗產品作為捕獲步驟的首選,幾乎所有商業批準的單抗產品制造工藝均使用蛋白A填料作為捕獲步驟。 應用:抗體藥物生產,用于從細胞培養液中高效捕獲和純化抗體藥物。 2 Protein A親和層析填料選型 Cytiva從1978年就已經有可以用于工業化的蛋白A填料了,之后的幾十年中,為適應抗體市場的需求飛速變化,Cytiva對蛋白A填料產品不斷升級,一次次推出革命性的產品。Mabselect家族是Cytiva最經典的蛋白A親和純化系列產品,擁有良好的口碑和大量的成功案例。其中,Mabselect PrismA從2017年上市到現在,一直是市面上載量和壽命同時最高的蛋白A親和填料, 尤其受大規模生產客戶的認可。 2025年,Cytiva基于40余年Protein A層析技術積淀,推出MabSelect SuRe 70與PrismA X兩款全新填料,覆蓋從臨床研發到商業化生產的全周期場景,助力企業實現效能與成本的最優平衡。 3 Protein L親和層析填料選型 蛋白L是一種可以特異性結合抗體kappa輕鏈可變區的蛋白,適用于IgA、IgD、IgG和IgM等抗體的純化。Mabselect VL是Capto L的升級產品,動態結合載量更高帶來更高的生產效率,耐堿性更高帶了更長的使用壽命和更低的污染風險,蛋白L親和多用于雙特異性抗體或抗體片段如Fab、scFv、Dab的純化。 # END # 部分圖片、字體、文字來源于網絡 如有侵權請聯系刪除